大阪薬大で検索： 53件 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P1】I-043 新規ヒスタミンH3及びH4リガンド創製を目指したテトラヒドロピラン誘導体の合成研究 ○川村誠1, 荒木理佐1, 春沢信哉1, 坂本靖彦2, 橋本剛3, 日高亮子3, 大和谷厚3, 栗原拓史1（1大阪薬大,2アズウェル,3阪大・医・保健）【目的】新しいヒスタミン受容体として、2000 年にH4 受容体が発見された。一方、我々はH3 作動薬であるイミフラミンの誘導体の中からH4 受容体に選択性を示す作動薬、OUP-13、OUP-16 を見出している｡1) 今回、新規ヒスタミンH3、H4 リガンドの創製を目指して、テトラヒドロピラン(THP) 誘導体の合成を検討した。【方法および結果】オレフィン1 にPhSeCl を反応させると、予想した5 員環6 の形成は見られず、THP 体4 が選択的に生成した。この結果は、閉環反応の中間体としてジアザフルベン3 を経由することを示唆している。現在、4 からイミフラミンホモローグ5 の合成を検討中である。1) T. Hashimoto et al, J. Med. Chem., 46, 3162 (2003). - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P1】I-045 C-4置換イミダゾール C-ヌクレオシドホスホロアミダイトの合成研究 ○荒木理佐1, 山口真帆1, 春沢信哉1, 栗原拓史1, Z. Zhao2, D. M. J. Lilley2（1大阪薬大,2ダンディー大）【目的】D型肝炎ウイルス由来の自己切断型リボザイムでは、活性中心のシトシンが突然変異してもイミダゾールにより触媒活性が保持されることが最近報告されている。一方、同じ触媒活性を持つVSリボザイムの変異体では、イミダゾールを添加しても触媒作用は回復しない。そこでRNAに対するイミダゾールの役割を明らかにするために、リボザイムの活性中心にC-4置換イミダゾールを挿入したRNAの合成を目的として、ホスホロアミダイト1の合成を検討した。【結果・考察】当教室からすでに報告しているトリベンジル体 2 1) を中間体として用い、自動合成に適したイミダゾール窒素の保護基を種々検討した結果、POM 基が有用な保護基であることを明らかとし、1aの合成に成功した。しかし、合成ルートの効率性や 1aの安定供給などに問題を残していた。今回、DNA領域のイミダゾール合成ユニット 1bの合成及び、 1a, 1bの改良合成について報告する。 1) T. Kurihara et al., J. Org. Chem., 1996, 61, 4405. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P1】I-046 イミダゾールC-ヌクレオシドホスホロアミダイトのSIMS法におけるマトリックスの検討 ○藤嶽美穂代1, 荒木理佐1, 山口真帆1, 春沢信哉1, 栗原拓史1（1大阪薬大）自己切断活性を持つD型肝炎ウイルス(HDV)のリボザイムでは、その不活性型変異体にイミダゾールを加えると、触媒活性を回復することが最近報告された。そこで我々は、RNAに対するイミダゾールの役割を明らかにする目的で、活性中心にイミダゾールを挿入したRNAを設計し、その自動合成に適した新規イミダゾールC-ヌクレオシド(ICN)ホスホロアミダイト1を合成した。しかし1は、不安定な化合物であるため、通常のEI/CI-MS, SIMS法による分子イオンの測定ができなかった。今回、SIMS法において、マトリックスを種々検討したところ、トリエタノールアミンにNaClを添加することにより、高感度で安定した分子量関連イオンピークの検出に成功した。現在、ホスホロアミダイト(PA) に対してMALDI法がよく用いられるものの、正確な精密質量が得られないのが現状である。下表に示すように、1に対するSIMS法の誤差は、わずか0.4 ppmであり、組成決定に必要な高分解能質量分析において充分な結果が得られた。本法は、ICN-PA類のいずれについても適用できたことから、広くPAに一般性を持つものと期待している。 1TheoreticalIonization ObservedErrormass(m/z)methodsmass(m/z)(ppm)[M+Na] +953.4621 SIMS 1) 953.4625 0.4 MALDI 953.5199 60.61) Measured using triethanolamine-NaCl matrix - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P1】I-220 水溶性キラル環状α,α-ジ置換アミノ酸よりなるオリゴペプチドの二次構造 ○出水庸介1, 田中正一1, 土井光暢2, 栗原正明3, 末宗洋1（1九大院薬,2大阪薬大,3国立衛研）【目的】光学活性な環状???-ジ置換アミノ酸Ac5cdiOMeは、１）?位が不斉中心でない、２）環状の側鎖上にのみ不斉中心がある、３）アミノ酸側鎖の官能基により水溶性が増しているという特徴がある。今回、このジ置換アミノ酸を含有するホモおよびヘテロペプチドのコンフォメーション解析を行うことを目的とした。【実験・結果】コンフォメーション解析は、X線結晶解析を用いた結晶状態、 1H-NMR、2D-NOESY、 FT-IR、CDスペクトルを用いた溶液状態、また分子力場法を用いたコンフォメーションサーチを行った。ホモヘキサペプチドは、結晶ならびに溶液状態において左巻き(M)310-ヘリックス構造を形成し、ホモオクタ、デカペプチドは左巻き(M)?-ヘリックス構造を形成していた。Ac5cdiOMeを種々のアミノ酸に導入したヘテロペプチドのコンフォメーションについても併せて報告する。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P1】I-223 X線結晶構造解析を指向したTemplate-assembled Synthetic Protein (TASP) の鋳型分子の開発およびその構造研究 ○塚本効司1, 前崎直容1, 田中徹明1, 大石宏文2, 鈴木健司3, 火山陽一3, 大床真美子4（1阪大院薬,2大阪薬大,3大日本製薬,4近畿大薬）【目的】タンパク質間相互作用の解明は、タンパク質のフォールディングや機能発現機構を理解する上で極めて重要である。鋳型分子に、相互作用を調べたいペプチド鎖を共有結合させて天然型タンパク質を簡略化した人工タンパク質 template-assembled synthetic protein (TASP) を用いた研究が行われているが、 X線結晶構造解析による構造解析の例は少ない。我々はcalix[6]areneを鋳型とするTASPを合成し、X線結晶構造解析によってペプチド間相互作用を解明すべく本研究に着手した。【方法】研究当初は1にペプチド鎖を導入してX線結晶構造解析を行うことを考えたが、ペプチド鎖が長くなるにつれて直接法による位相の決定が困難になると考えられた。そこで、重原子Brを有する非天然型アミノ酸である p-bromophenylalanineを1に導入した2を鋳型とし、多波長異常分散 (MAD) 法により位相を決定することとした。【結果】1から高収率で合成した2を結晶化しX線回折データを測定した。得られたデータに対しMAD法を適用したところBr原子の座標が求められ、位相を決定することができた。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P2】I-265 ヌクレオシド系酵素阻害剤の構造活性相関 ○松本洋亘1, 飯田彰1, 富岡清1, 和田俊一2（1京大院薬,2大阪薬大）【目的】我々は抗腫瘍活性化合物の創製を目指し、DNA代謝系酵素を標的とするヌクレオシド系化合物の設計と合成を行っている。その一環としてすでに、DNA トポイソメラーゼIIの作用機序に基づく新しいタイプの阻害剤としてヌクレオシド 1を見出している。今回、1のDNAトポイソメラーゼII阻害活性に関する構造活性相関を検討したので報告する。【結果および考察】1 のジメトキシ体である2 は、全く阻害活性を示さなかった。一方、興味深いことに2 の前駆体である3 では阻害活性が復活することが分かった。そこで、活性発現構造を明らかにするべく、2 の合成中間体やその誘導体の活性評価を行ったところ、3 以外にも阻害活性を示すいくつかの化合物があることが分かった。その結果、ヌクレオシドの核酸塩基は活性発現に必須ではなく活性増強に寄与していること、ならびにシリル基によるヒドロキシメチル基の保護が活性発現に重要な構造要因であることなどが明らかになった。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P2】I-319 生薬の電子線照射により発生した有機フリーラジカルの検出 ○山沖留美1, 岡部瞳1, 上野志真1, 木村捷二郎1, 野坂和代2, 塩路哲也2, 西本進2（1大阪薬大,2日本電子照射サービス関西セ）【目的】生薬の放射線照射殺菌処理は、成分変化が少なく有効な微生物汚染対策の方法として期待されている。しかし、生薬中に発生するフリーラジカルの生成量やその作用について十分に調べられていない。本研究では、葉、樹皮、果実、根を薬用部位とする生薬の電子線(ＥＢ)照射時に発生する有機フリーラジカルの検出とその物理的特性を調べるとともに、生物的特性として変異原性の発生の有無について調べた。【方法】試料；黒胡椒、甘草、桂皮、芍薬、センナ、蘇葉。EB照射；ダイナミトロン型5MeV電子加速器(RID)。1～20kGy。線量測定；CTA線量計、RC線量計。 ESR測定；ES-10(日機装(株))、330±15mT。変異原性試験；umu-試験。【結果】植物生薬には未処理状態で328ｍT付近(g=2.0034～2.0048)に有機ラジカルピークが検出され、その強度は葉類生薬で大きく、熱処理を行うことでも増加する。EB照射によって、このラジカル種は吸収線量に応じて増加する。照射後、ラジカル量は経過時間に対して指数関数的に減少するが、その寿命は比較的長く、芍薬、センナ、蘇葉では、照射1年後(16～17kGy、室温暗所保存)において未照射試料の2倍近く検出された。一方、黒胡椒、芍薬、蘇葉には326ｍTから331ｍT付近に照射により発生したラジカルピークが検出された。黒胡椒と蘇葉の照射由来ラジカルの寿命は数週間程度であるが、芍薬の照射由来ラジカルは複雑な微細ピーク状を呈し、照射後1ヶ月を経てもほとんど減衰しない。また、umu試験で蘇葉と芍薬の煎液は既知の変異原物質である4NQO(S9-)と2AA(S9+)に対して抗変異原性を示す。EB照射により蘇葉と芍薬中に新たな変異原性は確認されないが、芍薬では 4NQOと2AAに対する抗変異原性の減弱傾向が認められる。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P2】I-428 永寧独活(Heracleum yungningense)の成分研究谷口雅彦1, ○横田修1, 芝野真喜雄1, 馬場きみ江1, 王年鶴2（1大阪薬大,2 中国江蘇省植物研）【目的】セリ科植物の一環として、中国産のHeracleum yungningense Hand.-Mazz. (永寧独活)の根の成分検討を行った。H.yungningenseは、中国雲南省の海抜2,700 ｍの地域に広く分布しており、高さが約1ｍで全体が粗毛に被われている多年生草本である。これまでほとんど成分研究がなされていない植物である。【実験・結果】中国雲南省鶴慶で採取したH.yungningenseの根の酢酸エチルエキスおよびメタノールエキスについてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを多用して、21種の既知クマリン類、2種の既知フェニルプロパノイド、1種のポリアセチレンおよび4種の新規クマリン類(下記の１～４)をそれぞれ単離した。既知化合物については、各種スペクトルデータの解析および標品のスペクトルデータとの比較により、それらの構造を確認した。さらに1種の新規クマリンを単離しているが、その構造については現在検討中である。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P2】I-433 白亮独活（Heracleum candicans)の成分研究（その3）谷口雅彦1, ○中森輝恵1, 芝野真喜雄1, 馬場きみ江1, 王年鶴2（1大阪薬大 ,2中国江蘇省植物研）【目的】先に我々は、白亮独活（Heracleum candicans WALL.）の根について検討を行い、1９種のクマリン類、1種のポリアセチレン、４種のスピロ型フラノクマリン二量体、及び２種のフラノクマリン二量体を単離し、報告した＊。今回、引き続き本植物の成分検討を行ったので報告する。【実験及び結果】中国雲南省鶴慶県で採取されたH. candicansの乾燥根をアセトンで室温抽出し、得られたエキスについて、各種クロマトグラフィーを用いて分離、精製し、新たに１種のフラノクマリン二量体、１種のフラノクマリン三量体、 1種のフェニルプロパノイド誘導体、1種のポリアセチレン、及び６種のクマリン類、および１種の新規フラノクマリン二量体（１）を単離した。また、この他数種のスピロ型フラノクマリン二量体、スピロ型フラノクマリン三量体、フラノクマリン三量体の存在も確認されているが、それらの構造については現在検討中である。＊日本生薬学会第49回年会講演要旨集 118頁 ( 福岡 , 2002 ) ＊日本薬学会第123年会講演要旨集2 138頁 ( 長崎 , 2003 ) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 31【P2】I-356 多苞藁本（Ligusticum involucratum）の成分研究（その3）谷口雅彦1, ○奥野綾子1, 芝野真喜雄1, 馬場きみ江1, 王年鶴2（1大阪薬大 ,2中国江蘇省植物研）【目的】セリ科植物である Ligusticum involucratum FRANCH.は、中国雲南省・四川省の海抜 2800～4000ｍに自生する多年草である。先に我々は本植物について検討を行い、10種のクマリン、1種のフェニルプロパノイド、1種のフタリド、1種のポリアセチレン及び3種の新規セスキテルペノイド(1～3)を単離、報告した 1,2)。今回さらに詳細な成分検討、構造解析を行ったので報告する。【実験・結果】中国雲南省鶴慶県で採取されたL.involucratum の根の酢酸エチルエキス及びメタノールエキスを、各種カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、既知化合物として新たに6種のクマリンと1種のフェニルプロパノイドを単離、同定した。また新規化合物としてはクマリン(4)を単離、その構造を推定した。さらに、数種の化合物を単離しているが、それらの構造については現在検討中である。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 31【P2】I-358 モミジバフー球果より単離した新規トリテルペノイドの構造とヒト癌細胞パネルにおける制癌効果 ○福田優子1, 酒井邦佳1, 和田俊一1, 松永春洋1, 田中麗子1, 矢守隆夫2 （1大阪薬大,2癌研）［目的］新規生理活性物質の探索とその化学構造解明を目的としてマンサク科植物モミジバフー (Liquidambar styraciflua) 球果成分について検討を行った。［実験・結果］新鮮球果6.8 kgのCHCl3エキス98.3 gをシリカゲル、Sephadex LH-20等のカラムクロマトで分離し、新規トリテルペノイド(1)、(2)の他9種の既知化合物を単離した。それぞれの構造はMS、各種2D NMRスペクトルの解析により 25-acetoxy-3?-hydroxyolean-12-en-28-oic acid(1)、 3?,25-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid (2)と決定した。(1)、(2)についてヒト癌細胞パネル (HCC)を使って制癌評価を行ったところ化合物 (1)は大腸癌 HT-29、HCT-116細胞に対し強い効力を示した。また、平均有効濃度が低く、新規作用機作を持つ可能性が示唆されたが、関連する化合物 (2)は阻害効果が弱かった。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 31【P2】I-407 アメフラシ由来真菌の細胞接着阻害物質の構造 ○山田剛司1, 原田和佳1, 平村美香1, 箕浦克彦1, 沼田敦1（1大阪薬大）【目的】海洋生物由来菌類の抗腫瘍性代謝産物の探索研究の一環として，アメフラシ由来真菌Periconia byssoides の代謝産物について検討し，これまでに抗腫瘍性物質としてpericosine類を単離しているが，その分離過程で細胞接着阻害を示す数種のmacrosphelide類及びperibysin類をも単離し報告した．今回，同菌代謝産物をさらに精査し，３種の新規化合物peribysin G-I （1-3）を得，これらの化学構造の解析を行った．これらはすべて強い細胞接着阻害活性を示したのであわせて報告する. 【実験・結果】同菌をマルトエキスを主成分とする海水培地で27℃，4週間培養した．培養ろ液のACOEtエキスをLH-20及びシリカゲルのカラムクロマト並びにHPLC （ODS）により分離を行い，化合物1-3を単離した．これらの無色油状の化学構造は各種スペクトルの解析により下記のように推定した．これらの化合物は，in vitroにおいてヒト正常さい帯血管細胞（HUVEC）へのヒト急性骨髄性白血病細胞（HL-60）の接着を強く阻害した． - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 31【P2】I-448 ゴマリグナンの抗高血圧作用機序について ○中野大介1, 石井史絵1, 川西秀明1, 車塚大輔1, 高岡昌徳1, 中井正晃2, 小野佳子2, 木曽良信2, 田中隆治2, 松村靖夫1（1大阪薬大,2サントリー健康科学研）【目的】当研究室では、これまで様々な実験的高血圧モデルにおいてゴマリグナン（セサミン）の摂取が血圧上昇を抑制することを報告してきた。今回、その機序についてdeoxycorticosterone acetate（DOCA）食塩高血圧ラットを用いて検討を行った。【方法】対照動物とDOCA 食塩動物をそれぞれ、1）標準飼料群（control 群）、 2）0.1% セサミン含有飼料群（0.1% 群）、3）1% セサミン含有飼料群（1% 群）、 4）SOD mimetic 処置群（tempol 群）、5) 3 種降圧薬（レセルピン、ヒドロクロロチアジド、ヒドララジン）処置群（3T 群）に分け、5 週間飼育した後、大動脈におけるスーパーオキシド（O2.）産生量の測定と血管作動性薬物に対する反応性の変化について検討を行った。またセサミン代謝物を抽出し、摘出大動脈における収縮反応に与える影響について検討を加えた。【結果】DOCA 食塩処置による血圧の上昇は0.1% 群、1% 群、tempol 群および3T 群において有意に抑制された。大動脈におけるO 産生はDOCA-control 群と比べ、 0.1%、1% 群、tempol 群において有意に抑制されたが、3T 群において変化はみられなかった。O 産生酵素であるNADPH oxidase の活性はDOCA-control 群と比べ、 1% 群において明らかに抑制されていた。アセチルコリンによる弛緩反応は DOCA-control 群と比べ、0.1%、1% 群、3T 群において改善がみられたが、tempol 群において差は認められなかった。なおsham ラットにおいてはいずれの処置もO 産生量、血管反応性に影響を与えなかった。摘出大動脈におけるフェニレフリンおよび塩化カリウムによる収縮反応は、セサミン代謝物を処置することにより抑制された。このセサミン代謝物における収縮抑制作用は、抗酸化作用の強度とは逆相関するものであった。【考察】DOCA 食塩誘発性高血圧に対するセサミンの抗高血圧作用機序として、 NADPH oxidase の活性抑制作用を介したO 産生の抑制効果および代謝物による血管収縮抑制効果の関与が考えられ、これらにより血圧上昇が抑制された結果、内皮機能障害の進展が改善したと考えられる。. 2 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】I-046 Glycyrrhizinとシクロデキストリン類の相互作用 ○上垣内みよ子1, 中村有美1, 山下友紀子1, 吉田貴美1, 村瀬静香1, 碇子奈央1, 川西和子1, 西庄重次郎1, 石田寿昌2（1神戸薬大,2大阪薬大）【目的】演者らは医薬品のシクロデキストリン類(CyD)との相互作用について調べている。カンゾウ(甘草、Glycyrrhizae Radix)の主成分であるglycyrrhizin(1)の CyD類による包接効果による水に対する溶解性の向上を期待して、これら分子間の相互作用ついて調べた。【実験】1の?-、??-、??-CyD添加による水に対する溶解度変化をUVスペクトル及び HPLCで測定した。また、NMRスペクトルにより1とCyD類との相互作用の様式を検討した。【結果及び考察】UV及び HPLCの結果より、1はCyD類添加により水に対する溶解性が向上し、?-、??-、??-CyDの中で?- CyDが特に顕著であることが明らかになった。水溶液中でのNMRスペクトルによるプロトンのケミカルシフト及びROESYスペクトルの結果から、1と?-CyDの相互作用が明らかになり、1のC/D/E環部分がCyDに包接されていることが推定された。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】I-051 タイプII型βターン構造をとるトリペプチドBoc-Phe-D-Pro-Gly-OMeが結晶中で形成する8分子会合構造について一宮祐子1, 浅野晶子1, ○土井光暢1（1大阪薬大）【目的】β-turn構造は、helixやsheet構造にならびポリペプチドにおける重要な３次構造の一つである。この構造をとりやすい配列としてはProとGlyやPheとPro の組合が知られており、β-turn構造を調べる上で興味あるアミノ酸の組合せである。このことから我々はβ-turn構造を取ると推測される直鎖トリペプチド Boc-Phe-D-Pro-Gly-OMe (1)を合成し、その結晶構造を明らかにした。【方法及び結果】１の結晶を90Kに冷却し、196,525反射を測定した。結晶は空間群P212121に属し、a=15.7024(9),b=22.967(1),C=51.537(3)Å,V=18,586(2)Å 3,Z=32であった。Dual-space recycling法によって初期構造を得、非対称単位中に８分子が存在していることが判明した。精密化は分解能0.82Åまでの反射に対してR=6.61%に収束し、構造決定した総分子量は3,468.0であった。1は８分子とも typeII β-turnに属しており、各分子の結晶学的違いは主にOMeの構造に見られた。結晶中ではOMeがcis型とtrans型の分子がそれぞれ４分子づつc軸方向に繰り返しならんだロット状の構造を形成していた。１と鏡像の関係にある部分構造 (D-Phe-Pro)をもつペプチドGSはtype II'β-turnであることを考えると、DLの組合せによってβ-turn typeを選択できる可能性が示唆された。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】I-052 生理活性ペプチドにおけるC-末端アミド基の構造化学的研究：Endomorphin-2及びそのフリー体の溶液中でのコンフォメーション解析 ○尹康子1, 箕浦克彦1, 石田寿昌1（1大阪薬大）【目的】生理活性ペプチドの多くはC-末端がアミド化されており、活性発現の際の重要性が示唆されている。そこでC-末端アミド化が生理活性ペプチドのコンフォメーション及びその分子間相互作用に及ぼす影響を構造化学的に解明する為に、 Endom orphin-2(EM 2:Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)とそのフリー体(EM 2OH:Tyr-Pro-Phe-Phe- OH)の溶液中での立体コンフォメーションを決定し、両者を比較する。【方法】オピオイドμ.レセプターに対して極めて高い親和性を持つ内因性ペプチドEM 2 とそのフリー体EM 2OH の軽水(10%-D2O/90%-H2O)中での1D H-NM R 及び各種2D H-NM R の測定を行った。更に擬似膜環境下でのコンフォメーション解析を行う為、ペプチドに対して40 倍量の重水素化dodecyl phosphocholine(DodPCho) を共存させた軽水中で同様の方法により測定を行った。【結果・考察】各プロトンの帰属並びにNH-Cα間のJ 値を求め、次いでROESY スペクトルによる近接プロトンの距離情報を求めた。又EM 2 はPro を含む為ROESY スペクトルを利用してtrans-cis 異性体を決定した。その結果、軽水中において EM 2 はtrans:cis=2:1, EM 2OH はtrans:cis=3:2 の割合で存在しているのに対し、DodPCho 共存下においては両者共にtrans 体のみが存在していた。現在、得られた距離情報を基にSimulated annealing 法を併用した分子動力学計算により溶液中での構造を計算している。今後、EM 2 とEM 2OH の代表的なコンフォメーションについて両者の差異とコンフォメーションに及ぼすC-末端アミド基の影響について考察すると共に、生体内で存在する可能性の高いコンフォメーションを推定する。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】I-057 アシジアサイクラマイド及びその誘導体のコンフォメーション研究(5) ○浅野晶子1, 山田剛司1, 沼田敦1, 土井光暢1（1大阪薬大）【目的】アシジアサイクラマイド(ASC)は分子内にチアゾール環(Thz)、オキサゾリン環(Oxz)を含む、cyclo(-Ile-Oxz-D-Val-Thz-)2という分子内二回回転対称をもつ抗腫瘍活性ペプチドである．我々はASCの対称性を崩した非対称誘導体を合成し、構造活性相関を検討してきた．その結果、コンフォメーション、活性の両面においてOxz環の重要性が示唆された．そこでOxz環に着目した誘導体について合成し、それらのコンフォメーション解析を試みた．【方法】ASCのOxz環の絶対配置を置換したジアステレオマー誘導体は10種考えられる．それらを合成し、X線構造解析、溶媒変化によるCD測定を行った．また活性測定にはP388マウスリンパ性白血病細胞を用いて行った．【結果・考察】今回は2箇所のOxz環の絶対配置(S,R)を(R,S)に置換したジアステレオマー誘導体のX線構造解析の結果を報告する．またアセトニトリルからトリフルオロエタノールに溶媒を徐徐に変化させてCDを測定した結果、溶媒変化に伴い、スペクトルが大きく変化するものとほとんど変化しないものとに大別された．スペクトル変化から溶液中でのコンフォメーション平衡が存在すると考えられるが、このコンフォメーション平衡が活性と相関があることが示唆された． - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】I-070 Caenorhabditis elegans由来キャップ結合蛋白質IFEの構造と機能に関する研究 ○藤崎裕行1, 安孫子芙美1, 佐伯綾子1, 友尾幸司1, 石田寿昌1, 三好洋2 （1大阪薬大,2聖マリアンナ医大）【目的】真核生物における蛋白質生合成開始因子の一つであるeIF4EはmRNAの5'末端に存在するキャップ構造(m7GTP)を認識して蛋白質生合成を開始させる重要な機能を有している。線虫（Caenorhabditis elegans）にはキャップ結合能を有する 5種類の翻訳開始因子（IFE1～5）の存在が確認されている。eIF4Eの機能発現には、ヒトにおいては内因性eIF4E制御蛋白質(4EBP)による制御が確認されているが、線虫においてはまだ明らかでない。そこで線虫におけるIFEの制御機構を解明することを目的として線虫由来IFEと4EBPの相互作用について研究した。【方法・結果】大腸菌より発現させたC.elegans由来IFE3、IFE5、及びIFE5変換体 NV-YLをm7GTP-Sepharoseカラムに吸着させ、m7GTPを添加し、m7GTP複合体として調製した。一方、4EBPは3種のイソ蛋白質(4EBP1～3)をGST融合として発現させ、 Glutathione Sepharoseカラムに吸着させ、Glutathione添加により精製した。これらの試料を用いて表面プラズモン共鳴(SPR)法による相互作用実験を行った。3 種の4EBPをリガンドとし、IFE3、IFE5及びIFE5変換体NV-YLをアナライトとして作用させたところ、IFE3が最も4EBPに対して親和性が高く、一方3種の4EBPのうち 4EBP1がすべてのキャップ結合蛋白質に対し一番親和性が高いという結果を得た。このことは4EBPとキャップ結合蛋白質の結合部位の立体構造の差異を示唆している。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】I-071 ヒト蛋白質生合成開始因子4Aと4Gの相互作用研究 ○堤之達也1, 麻植正子1, 森野重信1, 友尾幸司1, 石田寿昌1（1大阪薬大）【目的】ヒトタンパク質生合成開始因子のひとつであるeIF4Aは、mRNAの非翻訳領域において2本鎖RNAの2次構造を解く役割を有している。この機能発現には、他の開始因子であるeIF4EとeIF4GとともにeIF4Fを形成することが必要不可欠である。 eIF4Fの形成において、eIF4AはeIF4Gと直接結合しているが、その結合様式の詳細についてはいまだ明らかでない。本研究は、タンパク質生合成開始反応機構解明の一環として、eIF4Aの機能解析を目的とし、eIF4Gとの相互作用について解析を行った。【方法と結果】eIF4Gは他のisoformとの相同性により、N末端ドメイン、middleドメイン、C末端ドメインの3つのドメインに分けられている。本研究では、middle ドメインとC末端ドメインからなる4GMCと、C末端ドメインのみの4GCを調製し、それぞれのドメインとeIF4Aとの相互作用について検討した。ヒトeIF4Aと4GCはHis タグ融合タンパク質として大腸菌より発現させ、Niキレーティングセファロースを用いて精製を行った。一方、4GMCは、GST融合タンパク質として発現させ、 GST-Sepharoseカラムを用いて精製し、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製した。これら３種の試料を用いて、表面プラズモン共鳴(SPR)法による相互作用解析を行った。 eIF4Aをリガンドとし、4GMCおよび4GCをアナライトとして作用させたところ、それぞれが異なった結合能を示し、2ヶ所の結合部位の結合力は等価でなく、eIF4G のmiddleドメインに存在する結合部位がより重要であることが示唆された。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】I-077 Ｔａｕタンパク質のＰＨＦ形成機構の解明 ○平岡周子1, 姚天明1, 時政真理1, 友尾幸司1, 箕浦克彦1, 石田寿昌1, 澄田美保2, 谷口泰造3（1大阪薬大,2行動医科学研,3神戸大・バイオシグナル研）【目的】アルツハイマー病患者の脳内の病理学的特徴として、神経細胞死と神経原線維変化(PHF:Paired Helical Filament)と呼ばれる不溶性線維の蓄積が挙げられる。通常、神経細胞で軸策輸送などの役割を持つ微小管の伸長を促進する機能を有するTauタンパク質は、異常にリン酸化すると自己重合を起こし、PHFを形成することが知られているが、その機構については未だ明らかでない。Tauタンパク質分子中には、本来の機能発現に関係する4回繰り返し配列構造を有する微小管結合ドメイン(MBD)が存在する。本研究では、このMBD領域に着目しTauタンパク質の PHF形成能についての解析を行うことにより、痴呆症発症機構を解明することを目的とする。【方法】MBD領域に変異のないMBD4s wildはHis-tag融合タンパク質として大量発現させた。精製した試料を用いてCDスペクトルやＴhＳ蛍光強度測定などの分光学的手法により、種々の2.2.2－trifuluoroethanol（TFE）濃度下においてコンフォメーションとPHF形成との関係について解析を行った。また、PHF形成に影響を及ぼす因子についても同様に検討を行った。【結果・考察】MBD4s wildは生理的条件下ではランダム構造で存在し、TFE溶媒下ではへリックス構造をとり、その含有量は濃度依存的に増加していく。またPHF形成はランダム構造からへリックス構造へ移行する遷移状態（TFE20％付近）で最も促進されることがわかった。一般には凝集過程におけるβ-シート構造の重要性が考えられているが、これらの結果からβ-シート構造への直接的移行よりはむしろ何らかの中間体構造を介したPHF形成機構が存在するものと考えられる。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】I-078 tauタンパク質に存在する微小管結合ドメイン内フラグメントの溶液構造解析（２） ○時政真理1, 箕浦克彦1, 平岡周子1, 友尾幸司1, 石田寿昌1, 澄田美保2, 谷口泰造3（1大阪薬大,2行動医科学研,3神戸大バイオシグナル研）【目的】アルツハイマー病患者の脳内にはtauタンパク質がPHF(Paired Helical Filaments)という異常線維の形態をとって蓄積する。この蓄積には類似のアミノ酸配列が４回繰り返された構造を有する微小管結合部位(Microtubule Binding Domain;MBD)が関与していると考えられている。通常水溶性のランダム構造をとる tauタンパク質は、PHF形成時には不溶性のフィラメント構造に変化するが、その構造変化の詳細は不明である。我々はPHF形成に関する知見を得るために、CD、NMR スペクトル及び分子力学計算を用いMBDの各フラグメント(R1～R4)の溶液中での立体構造解析を行っている。今回は、MBDの2番目のフラグメントの部位変異体 (R2-K7P)についてトリフルオロエタノール(TFE)中での立体構造解析を行った。【実験・結果】R2-K7PのCDスペクトルは、R3と同様に水溶液中ではランダム構造をとっているが、TFE濃度の上昇に伴ってα‐へリックス含量が増加するCDカーブを示した。その溶液構造解析を各種NMRスペクトルの測定により解析している。まず、プロトンシグナルの帰属並びに距離・角度情報の収集はDQF-COSY,TOCSY,NOESY スペクトルの解析より行った。現在、CNSプログラムを用いた立体構造解析を進めており、これまでに解析した各種フラグメントデータと比較し、それぞれの立体構造と自己凝集能について考察する。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】I-094 新規構造を有する2種類のZ-DNA・Polyamine複合体のX線構造化学的研究 ○大石宏文1, 石田寿昌1, 鈴木健司2, 福山恵一3, Kazimierz Grzeskowiak4, 大床真美子5, 岡部亘雄5（1大阪薬大,2大日本製薬(株）,3阪大院理,4UCLA,5近畿大薬）【目的】私たちはB-Z転移機構、Z-DNAの安定化機構を明らかにするために様々な PolyamineとZ-DNA複合体のX線結晶構造解析を行ってきた。その中でZ-DNAを最も安定化することが分かったPolyamineを用いて2種類の実験（低温での結晶化、データ測定；室温での結晶化、データ測定）を行った。このようにエントロピーの異なる条件下で結晶化を行った場合にZ-DNAとPolyamineの構造に違いが生じるかどうかを検討し、Z-DNAの安定化機構に何らかの示唆を与えるかどうかを調査する目的で実験を行った。【実験】DNA d(CGCGCG)2とポリアミンN1-{2-[2-(2-Amino-ethylamino)- ethylamino]-ethyl}-ethane-1,2-diamineとの複合体を高塩濃度(Na+,Mg2+の濃度が高い状態)で結晶化を行い、更にエントロピー状態を変えるため4℃と20℃で結晶化を行った。4℃の結晶はクライオを使用して－170℃でデータ測定を行い、20℃ の結晶は20℃の室温でキャピラリーに封入しデータ測定を行った。データの解析は大阪薬科大学情報科学解析センターで行った。【結果・考察】2種類の結晶を解析した結果、セル、空間群、晶系ともにほとんど同じでOrthorhombic,空間群 P212121, 低温a=17.878Å, b=30.838, c=43.885室温 a=18.01, b=31.20, c=44.72だった。温度の高い室温ではエントロピーが増大し明らかに3軸ともに低温より長くなっていることが分かる。C軸が１Å近くも違うことから、DNAも室温のほうが螺旋軸に沿って長くなっていることが分かる。低温ではZ-DNAのマイナーグルーブにポリアミンがU字形で1本入りその上にも１本がおおいかぶるように入っていたのに対して、室温では2本のポリアミンが繋がるようにマイナーグルーブに入り込みあたかも三重螺旋のようになってポリアミンがナノワイアー構造を作り上げていることが分かる。このような違いはDNAの形状にも違いを示し、室温のZ-DNAはCYT5がZ-II型になっていたのに対し、低温のZ-DNAは CYT5,CYT11の二箇所がZ-II型になっていた。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】I-129 ピラゾールを架橋配位子とするシスプラチン関連白金(II)二核錯体とDNAとの相互作用：ピラゾールの４位にメチル基を導入した場合の影響佐藤卓史1, ○和田隆平1, 和田幸恵1, 米田誠治1, 齊藤睦弘1, 千熊正彦1 （1大阪薬大）【緒言】演者らは従来、制癌活性を有する白金(II)二核錯体 [{cis-Pt(II)(NH3) 2}2(μ-OH)(μ-pz)](NO3)2(1,2-μH-Ampz)とDNAとの相互作用の解析を行ってきた。また、1,2-μH-Ampzの架橋配位子であるピラゾールの４位にメチル基を導入した白金(II)二核錯体 1,2-μH-Am-4mpzを合成し、その化合物が1,2-μH-Ampzよりも高い制癌活性を有することを明らかにした。そこで今回は、1,2-μH-Am-4mpz とDNAとの相互作用について1,2-μH-Ampzとの比較を行った。【方法】DNAの巻戻し：5μg/mlのプラスミドColE1 DNA（6646bp）に塩基対当り 0.05～5.0倍量の1,2-μH-Am-4mpzを作用させた後、0.7%アガロースゲルを用いた電気泳動法により分析した。CDスペクトル：20μg/mlの仔牛胸腺DNAに塩基対当たり0.1～3.0倍量の1,2-μH-Am-4mpz を共存させて、220～350nmの範囲についてCD スペクトルを測定した。平衡透析：120μg/mlの仔牛胸腺DNAに塩基対当り0.01～ 0.5倍量の1,2-μH-Am-4mpz を共存させて平衡透析を行った。【結果・考察】超らせんプラスミドの電気泳動移動度に与える影響については、 1,2-μH-Am-4mpzを共存させただけで泳動距離を低下させた。また、1,2-μ H-Am-4mpzを2時間反応させた場合、ある濃度までは先と同様に超らせんプラスミドの泳動距離は短くなったが、逆にそれ以上の濃度では泳動距離が長くなった。この現象は、1,2-μH-Ampzとは明らかに異なるものであった。次に、CDスペクトルにおいては、1,2-μH-Ampzと同様の270nm付近のコットン効果の低下が濃度依存的にみられたが、その作用は1,2-μH-Ampzよりも低い濃度から引き起こされた。さらに、平衡透析の結果から、1,2-μH-Am-4mpz でも1,2-μH-Ampzと同様に比較的強い結合と弱い結合の二種の結合が存在すると考えられた。その強い結合の結合定数は1,2-μH-Ampzと同程度であるものの、結合サイト数は1,2-μH-Ampzよりもかなり少ないことが示された。以上の結果より、1,2-μH-Am-4mpzはDNAに対して1,2-μH-Ampzとは異なる影響を及ぼしていることが明らかとなった。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】I-130 ピラゾールを配位子とするシスプラチン関連白金(II)二核錯体とDNAとの相互作用：静電的作用からDNA単分子内高次構造変化まで ○和田幸恵1, 佐藤卓史1, 秋田谷龍男2, 中井唱3, 吉川研一3, 米田誠治1, 齊藤睦弘1, 千熊正彦1（1大阪薬大,2CREST,3京大院理）【緒言】演者らはこれまでシスプラチン耐性癌細胞に対しても有効である[{cis-Pt (II)(NH3)2}2(μ-OH)(μ-pz)](NO3)2(1,2-μH-Ampz)がDNAと静電的な相互作用を行うことを明らかにした。今回は1,2-μH-Ampz とDNAとの反応において臭化エチジウム(EtBr)や4'-6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)を共存させた場合のCDスペクトルや蛍光強度の変化から1,2-μH-AmpzのDNA上の結合部位を解析した。また、蛍光顕微鏡や原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、DNA単分子観察をすることにより 1,2-μH-Ampz がDNAの高次構造に与える影響を検討した。【方法】（結合部位の解析）：EtBrあるいはDAPIを作用させた子牛胸腺DNAに任意の割合で1,2-μH-Ampzを作用させ、反応直後にCDスペクトル、EtBrあるいはDAPI の蛍光強度を測定した。（高次構造変化の観察）：T4 DNAに任意の割合で1,2-μH-Ampzを作用させた後、 YOYO-１により染色したDNA単分子の蛍光顕微鏡像を観察し、長軸長の測定を行った。また、同一のDNA分子について、蛍光顕微鏡とAFMの同時測定を行った。【結果・考察】CDスペクトル、蛍光強度の変化より1,2-μH-AmpzはEtBrに対して競合的に、DAPIに対しては非競合的に作用していることが明らかとなった。蛍光顕微鏡観察によりDNAは液相中でコイル状態で、長軸長は1,2-μH-Ampzの濃度の増加に伴って減少し、700μMを境に急激に凝集した。長軸長の短いDNAをAFMで観察したところ、分子中に緩やかに折りたたまれた構造が見出された。以上の結果、 1,2-μH-Ampzは静電的な相互作用によりDNAの高次構造を変化させているものと考えられた。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P2】I-281 ｍ-カルボキシフェニルフルオロンを用いる亜鉛（ＩＩ）の吸光光度定量法について神野伸一郎1, 森照美1, 臣永宏1, ○山口敬子1, 藤田芳一1（1大阪薬大） [目的]生体中の亜鉛イオン{Zn(II)}は, 多くの組織・組織液中に分布しており, 種々の生理機能を有し, また, 肝疾患, 筋疾患, 血液疾患, 内分泌疾患等多くの疾患と関連している。吸光光度法は, 簡便性, 経済的効率などの面で優れているが, 感度, 選択性などの点で問題になる場合も多いが, フロー法やメンブランフィルター前濃縮法等と組み合わせることにより, その欠点を十分補うことができる。従って, Zn(II)の高感度有機試薬を新規に開発し, 吸光光度定量法を構築することは非常に有意義である。演者らは, キサンテン系色素のm-カルボキシフェニルフルオロン(MCPF)を, 弱塩基性域で陽イオン界面活性剤を共存させるとき, Zn(II) との間に鮮明な呈色体が生成することを認めたので, 今回, MCPF を用いるZn(II) の吸光光度定量法について検討した。[実験方法と結果] Zn(II)の吸光光度定量法の基礎的定量条件.呈色時の液性, 界面活性剤の種類と濃度, MCPF 濃度, 呈色体の安定性など.を常法に従って検索して設定した定量操作は次の通りである。10 mL のメスフラスコに0.2 ～ 2.5 μg のZn(II)含有液, 1.0×10-2 M 塩化ステアリルトリメチルアンモニウム液1.5 mL, トリス.塩酸緩衝液2.5 mL及び1.0×10-3 M MCPF 液1.0 mLを加え, 水で全量10 mL とした後, 室温で15 分静置した本溶液の吸光度を, 同様に処理して得た試薬ブランク液を対照に560 nm で測定する。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P2】I-282 フェニルフルオロン－パラジウム（ＩＩ）錯体の退色を利用するクレアチニンの吸光光度定量法の開発藤本剛1, 西川英里1, 綾城裕子1, 山口敬子1, ○藤田芳一1（1大阪薬大） [目的]血清・尿クレアチニン(Cr)値は, 腎疾患, 筋疾患, 内分泌疾患など多くの疾患の指標として汎用されている。また, 近年糖尿病性腎症の早期発見には随時尿の濃縮・希釈をCr 補正したアルブミン指数が診断に活用されている。生体中Cr 測定法としては, Jaffe 反応を利用するFolin-Wu 法などが用いられているが, 簡便, 高感度定量法は少ない。今回演者らは, Cr が金属イオンと錯生成する特性に着目し, 金属イオンに対する色素とCr との競合反応を利用する新規Cr の分析法の開発を目的として検討した。[方法]使用する金属イオン及び色素の組み合わせの予備的検討の結果, 非イオン性界面活性剤共存下, パラジウム(II)イオン{Pd (II)}およびキサンテン系色素のフェニルフルオロン(PF)の組み合わせが, 感度の面で最適であることを認めた。[結果と考察]設定した定量操作は次の通りである。 10 mLのメスフラスコに0.2 ～2.5 μgのCrを含む液, 1.0% ポリビニルアルコール液1.0 mL, 5.0×10-4 M Pd(II)液0.6 mL, ホウ砂.塩酸緩衝液2.5 mL及び1.0×10-3 M PF液0.6 mLを加え, 水で全量10 mLとする。ついで65℃で25 分加温反応, 水冷した後の640 nmにおける本溶液の吸光度と, 同様に処理して得た試薬ブランク液の640 nmの吸光度の差を求める。本操作法によるCr定量法は, 極めて感度が高く , 生体中の微量Cr の分析に十分適用できることが示唆された。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P2】I-328 キャピラリー電気泳動法による抗菌薬ニューキノロン類の光分解反応の解析 ○山本和秀1, 佐藤卓史1, 齊藤睦弘1, 千熊正彦1（1大阪薬大）【目的】抗菌薬として広く用いられているニューキノロン類は、副作用として光過敏症が挙げられる。この原因として紫外線によるニューキノロン類からの分解産生物が何らかの形で関連していると思われている。そこで、エノキサシン（ＥＮＸ）について、紫外線照射下での分解を活性酸素種及びフッ素化物イオンを指標として追跡した。加えてスパルフロキサシンとレボフロキサシンについても現在研究中である。【方法】活性酸素種の検出についてはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いて検討し、また、フッ素化物イオンの検出についてはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて検討した。【結果・考察】また、ＥＮＸからのフッ化物イオンの産生を検出することができた。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】III-042 Bacillus cereusスフィンゴミエリナーゼによるZn2+依存的溶血反応 ○森川浩治1, 藤井忍2, 池田潔2, 池澤宏郎1, 今川正良1, 塚本喜久雄1（1 名市大院薬,2大阪薬大）【目的】Bacillus cereusのスフィンゴミエリナーゼ（SMase）は菌体外分泌型の可溶性毒素であり、ウシなどスフィンゴミエリン（SM）含量の多い赤血球にCa2+ 促進的に吸着し、続いて膜表層のSMをMg2+依存的に加水分解して溶血を引き起こす。本酵素は中性から弱アルカリ性に至適pHを持つが、我々はMg2+非存在下において、弱酸性から中性のpHではサブmMオーダーのZn2+によってSM基質分解活性が発現することを見いだした。そこで溶血反応におけるZn2+の役割を明らかにするために、以下の解析を行った。【方法】Zn2+濃度依存的な溶血活性の変化を、中性（pH7.0）および弱酸性（pH6.0）で測定した。また本酵素の触媒および膜結合に必須なアミノ酸残基の変異酵素E53D、D100AおよびH151Aを用い、pH7.0およびpH6.0におけるSMミセルの加水分解活性のZn2+濃度依存性を測定した。【結果及び考察】pH7.0およびpH6.0では、0.1mMのZn2+によって完全溶血が観察され、Zn2+がMg2+の代りに溶血反応を活性化することが明らかになった。しかし pH7.0では、0.2mM以上のZn2+濃度で溶血反応が阻害された。これは、Zn2+による SMase阻害効果のためと考えられる。また野生型酵素のpH7.0およびpH6.0における SM加水分解活性は、約0.2mMのZn2+で最大に到達した。このZn2+依存的活性曲線は、E53D、D100AおよびH151A変異ではほとんど影響を受けなかった。しかしpH6.0 では、E53D変異酵素の50%活性化に必要なZn2+濃度が野生型酵素と比べて上昇し、 Zn2+がMg2+の代替イオンとして、Mg2+のリガンドとして機能するGlu53に配位して加水分解および溶血反応を活性化することが強く示唆された。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】III-086 アオダイショウ血清由来ホスホリパーゼA2阻害タンパクの精製 ○白井僚一1, 鳥羽通久2, 林恭三1, 池田潔1, 井上晴嗣1（1大阪薬大,2日本蛇族学術研）【目的】クサリヘビ科毒ヘビの血漿中には、自らの毒の成分であるホスホリパーゼA2(PLA2)の作用を中和する3種のPLA2阻害タンパク(PLI?、PLI?、PLI?)が存在する。これらの毒ヘビを食する無毒のシマヘビの血漿にもPLI?とPLI?が存在することから、シマヘビのこれらのPLIは毒ヘビの毒に対する防御タンパク質として機能していることが予想された。そこで、毒ヘビを食さない無毒ヘビであるアオダイショウに、PLIが存在するのかどうかを明らかにするため、アオダイショウの血清からPLI精製を試みた。【方法】アオダイショウの血清から、Blue Sepharose 6 Fast Flowカラム、Q Sepharoseカラム、Phenyl Sepharoseカラム、Superdex 200カラムなどを用いるクロマトグラフィーを行い、各画分についてPLA2に対する阻害活性の測定、および抗PLI抗体を用いるウェスタンブロットを行った。【結果と考察】Blue Sepharose 6 Fast Flowカラムに吸着したタンパク質は、 SDS-PAGEで約20kDaの分子量を示し、抗PLI?抗体に対して免疫交差性を示し、そのアミノ酸配列もPLI?のものと相同性が高かった。しかし、このタンパク質は中国マムシ毒由来の酸性PLA2の活性を阻害しなかった。一方、Blue Sepharose 6 Fast Flowカラムを素通りした画分をQ Sepharoseカラムでさらに精製した結果、この画分には、中国マムシ塩基性PLA2を特異的に阻害する50kDaのPLI?と、すべてのPLA2 を阻害する30kDaのPLI?が存在することがわかった。以上の結果から、PLIの発現に食性は関与しないこと、PLIは毒の中和作用以外に、何らかの生理作用をもつことが示唆された。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】III-087 毒ヘビ由来PLA2阻害タンパク質のヘビ毒による生合成促進作用 ○金川康師1, 渡辺晋2, 鳥羽通久2, 林恭三1, 池田潔1, 井上晴嗣1（1大阪薬大,2日本蛇族学術研）【目的】クサリヘビ科の毒ヘビの血液中には、自らの毒に含まれるPLA2に対して中和作用を示す3種類のPLA2阻害タンパク質（PLI?, PLI?, PLI?）が存在する。これらのPLIは生体防御タンパク質として機能すると考えられるので、ヘビ毒の注射によって、血中PLI濃度や肝臓におけるPLI遺伝子の発現に変化がみられるかどうかを調べた。【方法】タンビマムシ（Agkistrodon brevicaudus）の背部に粗毒4mgを筋肉内注射した後、経時的に肝臓の一部を採取した。採取した肝臓から全RNAを抽出し、逆転写後、ライトサイクラーを用いるリアルタイムPCR法によって、?-アクチンの発現量に対する3種のPLIの相対的発現量を求めた。一方、3種のPLIに対するELISAによる定量法を確立し、粗毒注射後の血中PLI濃度の経時変化を測定した。【結果と考察】粗毒の注射により、タンビマムシ肝臓におけるPLI?の遺伝子とPLI? 遺伝子の発現量は6時間後に約4倍に増加したが、PLI?遺伝子の発現量はほとんど変化しなかった。3種のPLIの血中濃度はいずれも粗毒注射後1時間まで減少したのち、徐々に増加した。このときPLI?とPLI?の血中濃度は48時間後に注射前の約1.5 倍になったが、PLI?については注射前とほぼ同じになった。粗毒の注射によって毒ヘビの肝臓におけるPLIの生合成が促進されたことから、毒の注射により誘導される自己防御機構の存在が示唆された。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】III-135 銅(II)イオンが誘導するDNA切断に対するGly-L-His-L-Lys の阻害作用佐藤卓史1, ○熊井仁美1, 齊藤睦弘1, 千熊正彦1（1大阪薬大）【緒言】活性酸素種(ROS)は様々な障害を細胞にもたらすが、このROS産生には種々の金属イオンが関与すると考えられている。特に、銅(II)イオンにアスコルビン酸を共存させるとそのROS産生によってDNAの切断が惹起される。一方、 Gly-L-His-L-Lys(GHK)は、生理的条件下でも銅(II)イオンと安定な錯体を形成し、その錯体が種々の生理活性を示すことが知られている。そこで、演者らは銅(II) /アスコルビン酸によって誘導されるDNAの切断がGHKによって阻害されるのではないかと考え、仔ウシ胸腺DNA及びL1210細胞を用いて銅(II)/アスコルビン酸系によるDNA切断に対するGHKの影響を検討した。さらに、演者らが作製したGHK- Cu2+に対する抗体がこのDNA保護作用に及ぼす影響についてもあわせて検討した。【方法】(1) 仔ウシ胸腺DNA にGHK共存下、非共存下で塩化銅(II)、アスコルビン酸を37℃ で2時間反応させた。その後アガロースゲル電気泳動法によりDNA切断を検出した。 (2) L1210細胞についても同様の反応を行った後、DNAを細胞から抽出精製し、アガロースゲル電気泳動法で分析した。【結果・考察】銅(II)/アスコルビン酸による仔ウシ胸腺DNAの切断はGHKの濃度に依存して阻害された。一方、保護作用がほとんど認められないGHK濃度においても、抗体を共存させることによってDNA切断が阻害されることも明らかになった。また、L1210細胞におけるDNA切断も仔ウシ胸腺DNAの場合と同様にGHKによって阻害された。これらのことより、GHKは銅（II）イオンと安定な錯体を形成することで、そのROS産生を抑制すると考えられた。さらにその作用は、抗GHK-Cu2+抗体によって増強されるものと考えられた。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】III-141 マウス精巣由来TM3 Leydig細胞におけるPACAP38の細胞増殖に与える影響について ○松本章士1, 荒川行生1, 片岡和三郎1, 黒川信夫1, 矢内原千鶴子2（1大阪大病院薬,2大阪薬大）【目的】我々はこれまでにマウス精巣由来TM3 Leydig細胞(TM3)におけるPACAP特異結合部位の存在およびPACAPによるtestosterone放出促進作用とそれに関与する細胞内情報伝達系の解析について報告をしてきた。本研究では、MTT法を用い、 PACAP38の細胞増殖に対する作用と、その作用に対する性腺ホルモンの影響について検討した。【方法】 TM3はDMEM/F12(牛胎児，馬血清添加)培地中，5%CO2, 湿度100%, 37℃で培養したものを用いた。96穴マイクロテストプレートにて104個のTM3細胞を、24 時間培養した後、各性腺ホルモン単独またはこれにPACAP38 を1nMに混合した培地（血清非添加）を添加して、24～72時間培養を行い、 MTT試薬を用い生細胞数を計測した。また、PACAP38の細胞周期に対する影響についてはflow cytometry (FCM)を用い、propidium iodide染色により細胞周期を測定して解析した。【結果、考察】PACAP38 1～100nM添加によりTM3の増殖は対照群に比べ約15～40% 濃度依存的に抑制され、FCMの結果からはG2/M期の細胞数の比率が増加し、24時間以後ではS期が減少しているのが明らかになった。細胞増殖作用を示すことが報告されているtestosterone, LH, HCGの共存下におけるPACAP38のTM3細胞増殖抑制作用を検討した結果、testosterone (10pg/ml～100ng/ml), LH (10pg/ml～ 1000ng/ml), HCG (0.1IU/ml )は、それぞれ単独ではTM3細胞増殖作用を示したが、 PACAP38 1nMとの共存下では細胞増殖抑制作用を有意に増強した。これらの結果は TM3細胞増殖に関しPACAP38と性腺ホルモンとの間の相互作用の存在を示唆するものであった。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】III-142 ラット小腸におけるGLP-2受容体mRNAの発現レベルに関する検討 ○池田賢二1, 荒川行生1, 竹上学1, 黒川信夫1, 廣谷芳彦2, 田中一彦2, 矢内原千鶴子2, 加藤郁夫3, 李軍3（1大阪大病院薬,2大阪薬大,3矢内原研）【目的】我々はこれまでに小腸部分切除ラットの残存小腸においてグルカゴン様ペプチド－２（GLP-2）の栄養効果を検討し、残存空腸粘膜および十二指腸粘膜に対する本ペプチドの増殖促進効果および生化学的指標の改善効果を明らかにした。本研究においては、ラット小腸の各部位におけるGLP-2受容体（GLP-2R）mRNAの発現レベルを測定・比較し、これら効果との関係を検討した。【方法】Wistar系雄性健常ラット（200g）から、十二指腸、空腸および回腸を、各々近位・中位・遠位を区別して摘出し、さらにこれら摘出組織を粘膜と非粘膜に分離して測定に供した。GLP-2R mRNA発現レベルは、ABI PRISM(r)7700システムによる定量PCR、および蛍光イメージアナライザーを用いた半定量PCRによって測定し、β-ACTIN・GAPDHにより補正した。【結果・考察】すべての小腸部位においてGLP-2R mRNAの発現が認められ、特に近位空腸の発現レベルは他に比べて有意に高かったが、平均発現レベルでは空腸と十二指腸に有意差はなく、回腸では有意に低かった。また、単位長あたりの発現レベルでは、すべての小腸部位において、非粘膜部位が粘膜部位の約１０倍を示した。以上、ラット小腸におけるGLP-2R mRNAの発現とその分布は、GLP-2がこれら受容体を介して作用すること、および我々が先に小腸部分切除ラットモデルにおいて明らかにしたGLP-2の栄養効果を裏付けるものであった。さらに、GLP-2Rが小腸の非粘膜部位にも広く分布している可能性より、粘膜外におけるGLP-2の作用が示唆された。また、粘膜部位と非粘膜部位とのGLP-2を介した相互作用等も考えられ、GLP-2の腸管における作用に関連する細胞及び因子の特定が今後の検討課題と考えられた。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】III-191 マクロファージの活性化により誘導されるiNOSの翻訳後活性調節機構 ○茶谷美由紀1, 天野富美夫1（1大阪薬大）【目的】従来よりiNOSの誘導に関する研究報告は多いのに対し、分解等の消失系については不明な点が多く残されている。そこで、マクロファージ培養細胞系を用い、iNOSの活性変動とタンパク質の消失を定量的に解析することにより、iNOS の翻訳後活性調節機構に関する検討を行った。【方法】iNOSの活性とタンパク質量が減少する時期を調べるため、マクロファージ系細胞株RAW264.7細胞にLPSとIFNγを添加することでiNOSを誘導させ、その後のNO産生活性とiNOSタンパク質量の変動をGriess ReagentとWestern Blottingにより2～4時間毎に調べた。次に、iNOS活性及びiNOSタンパク質発現量の減少に及ぼす培地の影響を調べるため、細胞刺激後16時間目に以下の５つの方法で前処理した培地に交換し、再加温後のNO産生およびiNOSタンパク質の変動を上記と同様の方法により調べた。 (1) 新しい培地 (2) 培地のみを16時間加温したもの (3) 培地にLPSとIFNγを添加し、16時間加温したもの (4) マクロファージに培地のみを加えて16時間加温したもの (5)マクロファージにLPSとIFNγを含む培地を加えて16時間加温したもの【結果・考察】iNOS活性とタンパク質量は、LPSとIFNγを添加後16～20時間目以降に減少した。よって、iNOSの分解はLPSとIFNγを添加後16～20時間目以降に起きていることが推察された。また、培地の影響について検討した結果、iNOSの分解は、LPSとIFNγでマクロファージを活性化することによって細胞内から培地中に放出される因子により調節されていることが示唆された。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P2】III-451 マクロファージのサルモネラ感染抵抗性及び活性酸素種に対する抵抗性に及ぼすサルモネラDps(SEp22)の影響 ○寺井志織1, 岡本鮎美1, 窪田智史1, 天野富美夫1（1大阪薬大） [目的]これまでの我々の研究から、サルモネラDpsであるSEp22はマウスに対するサルモネラの病原因子であることが示唆された。本研究では、SEp22がマクロファージ(Mφ)のサルモネラ感染抵抗性、ならびにサルモネラの活性酸素、一酸化窒素（NO・）等に対する抵抗性にどのような影響を及ぼすかについてSEp22の欠損株を用いて検討した。 [方法]Mφへの感染実験；Mφ細胞株はLPS感受性JA-4株とLPS非感受性LPS1916株を用い、活性化はLPSとIFNγで行った。それぞれの対数増殖期の菌株をMOI=100で感染させ、経時的に採取し、生菌数をCFU/mLで求めた。サルモネラの増殖阻害実験；37℃恒温水槽にて一晩、振盪培養し、静止期の菌を新鮮なLB培地で希釈後、OD550=0.1とし、各試薬と混合して1時間振盪培養した。菌をLB寒天培地に塗布し、コロニー数（CFU/mL）を調べた。 [結果および考察] Mφは通常、活性化を行うと活性酸素と一酸化窒素を産生するが、今回、用いたLPS1916株は活性化を行っても一酸化窒素をほとんど産生しない。本研究において、Mφへの感染実験では野生株と欠損株共に、活性化を行った細胞株で生菌数の減少が認められ、増殖阻害実験ではH2O2と混合培養した場合のみ、野生株に比し、SEp22の欠損株の生菌数の有意な低下が認められ、他の活性酸素類については両者に差は認められなかったことから、SEp22はMφ細胞内におけるサルモネラの感染抵抗性において活性酸素、特にH2O2に対する抵抗性に関係していることが考えられた。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P2】III-452 細菌由来DNAによるマクロファージ活性化機構について ○天野富美夫1, 唐橋久恵1, 佐々木裕美子1, 曽和洋平1（1大阪薬大）［目的］細菌由来DNAによるマクロファージ活性化機構を研究するため、大腸菌 DNA、CpGオリゴヌクレオチド(CpG-ODN)および対照としてリポ多糖(LPS)を用いて解析を行なった。［方法］マウスマクロファージ系細胞株RAW264.7細胞を用いて、IFNγ存在下、非存在下で、大腸菌由来のLPSまたはDNAを添加し、37℃、20時間培養して、その上清に遊離される一酸化窒素ラジカルに由来するNO2-、および炎症性サイトカインのTNFα産生を測定した。また、活性化の際にポリミキシンB(PolyB)を添加し、DNA あるいはLPSによるマクロファージ活性化に及ぼす影響を調べた。［結果と考察］大腸菌DNAは用量依存性にNO2-産生を誘導し、IFNγ非存在下では 10?g/ml以上、存在下では0.1?g/ml以上で有意な値が検出された。一方、TNFα産生はIFNγ存在下非存在下に関わらず0.1?g/ml以上で有意な値が検出された。次に、PolyBは0.1U/ml以上で濃度依存的に、LPSまたは DNAで誘導されるNO2-産生を最大80%まで阻害した。しかし、IFNγ存在下CpG-ODNで誘導されるNO2-産生のPolyB による阻害は小さく、逆に100U/mlのPolyBで促進された。さらに、PolyはTNFα産生についてもほぼ同様の阻害効果を示した。以上の結果は、マクロファージのDNA とLPSに対する応答性が異なることを示し、特に細胞表面への結合様式が異なることが示唆された。また、CpG-ODNとDNAのマクロファージ活性化能の違いは、利用する真の受容体がTLR9以外に複数存在することを示唆する。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】II-063 蛍光X線分析法とICP-MS法による食品中のミネラルと微量有害金属の定量 1.　貝類について ○三野芳紀1, 落合孝充1（1大阪薬大）【目的】蛍光X線分析法は、非破壊・多元素同時分析法であり、多数の試料の金属分析に有用である。しかし、軽元素や微量元素の定量は、感度不足のため困難な場合が多い。一方、ICP-MS法は、極めて高感度な分析法で、微量元素の分析には適しているが、高濃度の元素の分析においては、希釈操作に伴う汚染が深刻な問題となる。そこで、我々は、蛍光X線分析とICP-MSを組合せることで、試料中の主要な元素から微量金属まで定量する方法を確立した。この方法を用いて、数種の貝中の金属含量を測定した。【方法】蛍光X線分析：貝（中身）約20gをホモジナイズし、凍結乾燥して粉末とした。その粉末450mgをペレットに成形したものを試料とし、波長分散型蛍光X線分析装置(Rigaku ZSX)で検量線法にて分析した。測定元素はNa, Mg, Si, P, S, Cl, K, Ca, Mn, Fe, Cu, Zn, Br, Rb等である。 ICP-MS ：粉末試料100mgを湿式灰化（1ml 硝酸、マイクロウエーブ）し、純水で 100ml（1%硝酸）にメスアップしたものをICP-MS分析装置（Seiko SPQ9200）で測定した。測定元素はAl, Ti, V, Cr, Co, Ni, As, Se, I, Ba, Pb, Cd等である。【結果と考察】蛍光X線分析では、対象とした14元素の分析精度は、10%の誤差内であった。一方、ICP-MS法では、ほとんどの元素の精度は良好であったが、Al等の正確な分析は困難であった。数種の貝の身を分析した結果、同種の貝でも金属含量にかなりの相異がみられたが、貝の種類によって特徴的な金属含有パターンを示すことが明らかになった。有害金属については、問題となる濃度では含有されていなかった。なお、貝の重金属濃度は棲息地の水質の汚染度を反映することから、各地で採取した貝についても、分析結果を報告する予定である。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P1】II-064 蛍光X線分析法とICP-MS法による食品中のミネラルと微量有害金属の定量 2. 植物性食品について三野芳紀1, ○湯北真由美1（1大阪薬大）【目的】我々は、蛍光X線分析とICP-MSを組合せることで、試料中の主要な元素から微量金属まで定量する方法を確立した。この方法を用いて、数種の野菜中の金属含量を測定するとともに、その中に含まれる鉄分について、その化学形態分析を行った。【方法】蛍光X線分析：野菜は風乾後、粉末化し、その450mgをペレットに成形したものを試料とし、波長分散型蛍光X線分析装置(Rigaku ZSX)で検量線法にて分析した。 ICP-MS ：前者の発表と同様の方法で行った。【結果と考察】数種の野菜を分析した結果、Feでは600ppm(シュンギク)から20ppm （キャベツ）まで種類によりその含量は大きく異なり、同じ種類の野菜でも、大きく変動した（ホウレンソウの場合：90~400ppm）。Cuでは、パセリ（約50ppm）以外の野菜は低含量であり、Mnは茶葉に高濃度（500~1000ppm）で含まれていた。また、高濃度のBr (5000ppm以上)がいくつかのシュンギク,コマツナから検出されたことも興味深い。今後、より多くの試料について分析を行い、その結果を報告する予定である。野菜中のFeの化学形態について、ホウレンソウを試料として各種クロマト法と ICP-MSを組み合わせて検討した結果、溶解性の鉄分の内、約10%は鉄―硫黄タンパクの１種、フェレドキシンとして含まれていることが分かった。その他にも、数種の鉄含有成分の存在が明らかになった。それらの化学形態については、現在検討中である。ホウレンソウの結果を参考にして、他の野菜中のFeの化学形態についても比較検討する予定である。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P2】II-387 アシタバ特有のカルコン誘導体である4-Hydroxyderricinが脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット (SHRSP) の血圧ならびに脂質代謝に及ぼす影響 ○大野真美1, 小川博2, 馬場きみ江1（1大阪薬大,2近畿大医）【目的】アシタバ黄汁は、カルコン類やクマリン類に富み、脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット（SHRSP）を用いた研究から、軽度な血圧上昇抑制作用や脂質代謝改善作用が明らかとなっている。本研究では、その有効成分や作用機構を解明するため、アシタバ黄汁よりカルコン類の一種、4-hydroxyderricin（4-Hyd）を単離・精製し、SHRSPの血圧、脂質代謝に及ぼす影響を検討した。【方法】八丈島産アシタバ黄汁の酢酸エチル抽出画分より4-Hydを単離・精製し、実験飼料に0.07％添加した。実験動物は６週齢の雄性SHRSPを用い、実験飼料と飲水を７週間自由摂取させた。血圧は尾動脈圧をTail-pulse pickup法にて測定した。飼育終了後、麻酔下腹部大動脈採血を行うと同時に肝臓を摘出した。血清、各リポタンパク分画肝臓の脂質含量の測定は市販のキットにて行った。肝臓脂質代謝関連遺伝子発現動態は、RT-PCR法にて観察した。【結果および考察】飼料摂取量、成長曲線は両群間に有意な差はなかった。最高血圧は投与７週間目に実験群で有意な低値を示した。血清脂質含量は実験群で低値傾向を示し、超低比重リポタンパク（VLDL）分画脂質含量で有意な低値が認められたことから、4-Hydは血清VLDL減少作用を有すると考えられた。肝臓では、実験群で中性脂質含量が有意に減少し、その他の脂質含量に差はなかった。肝臓脂質代謝関連遺伝子発現では、実験群でMicrosomal triglyceride transferprotein (MTP), Fatty acid synthase (FAS) mRNAsの有意な減少が認められた。従って、 4-HydはMTP mRNA 発現減少により、肝臓でのVLDL合成・分泌を低下させ、さらに FAS mRNA発現減少による肝臓中性脂肪低下作用を有すると考えられた。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P2】II-390 アシタバ含有クマリン成分laserpitinが脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット (SHRSP) の脂質代謝機構に及ぼす分子・遺伝子レベルでの研究 ○中村玲子1, 小川博2, 馬場きみ江1（1大阪薬大,2近畿大医）【目的】これまでに、脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット（SHRSP）を用いた研究から、アシタバ黄汁の酢酸エチル抽出画分は、軽度な血圧上昇抑制作用や肝臓中性脂質低下作用を有することを報告した。本研究では、その有効成分や作用機構を解明するため、アシタバ黄汁よりクマリン類の一種、laserpitinを単離・精製し、SHRSPの血圧、脂質代謝に及ぼす影響を検討した。【方法】八丈島産のアシタバ黄汁酢酸エチル抽出画分よりlaserpitin (Isolaserpirinとの平衡混合物)を単離・精製し、実験飼料に0.1％添加した。実験動物は６週齢の雄性SHRSPを用い、実験飼料と飲水を７週間自由摂取させた。血圧は尾動脈圧をTail-pulse pickup法にて測定した。飼育終了後、麻酔下腹部大動脈採血を行うと同時に肝臓を摘出した。血清、各リポタンパク分画、肝臓の脂質含量はキットにて測定、肝臓脂質代謝関連遺伝子発現動態は、RT-PCR法にて観察した。【結果および考察】飼料摂取量にはほとんど差がなかったが、成長曲線は実験群で４週間目頃より低下した。血圧は両群間で差はなかった。血清脂質含量は実験群でコレステロールとリン脂質含量の有意な高値を示し、これは主に高比重リポタンパク(HDL）分画における有意な上昇に基づいていた。従って、laserpitinは血清HDL増加作用を有すると考えられた。肝臓では、実験群で中性脂肪含量が有意に減少し、肝臓脂質代謝関連遺伝子発現では、Adipocyte determination and differentiation protein 1（ADD1）, Peroxisome proliferator-activated receptor α（PPARα）, Scavenger receptor class B type 1 (SRB1) mRNAs発現の有意な減少が認められた。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P1】II-129 シスプラチン関連白金(II)二核錯体のヒト卵巣癌細胞に対するアポトーシス誘導能佐藤卓史1, ○青木典子1, 神田麻衣子1, 崎山愛子1, 大西慶彦1, 米田誠治 1, 齊藤睦弘1, 千熊正彦1（1大阪薬大）＜緒言＞演者らは、先に開発した白金(II)二核錯体[{cis-Pt(II)(NH3)2(?-OH) (??pz)}](NO3)2(1,2-?H-Ampz)及びそのピラゾラト配位子の4位にメチル基を導入した1,2-?H-Am-4mpzについてその癌細胞に対する作用を検討してきた。現在までに、これらの化合物がマウス白血病細胞L1210及びそのシスプラチン耐性細胞、あるいはヒト卵巣癌細胞TYK-nuに対してアポトーシスを誘導することを明らかにし、また、TYK-nuのシスプラチン耐性細胞であるTYK-nu.CP-rにも著明な細胞増殖抑制活性を示すことも明らかにした。今回は、TYK-nu及びTYK-nu.CP-rについてそのアポトーシス誘導の詳細及び細胞の形態学的変化について検討した。＜方法＞細胞：シスプラチン感受性ヒト卵巣癌細胞TYK-nu及びそのシスプラチン耐性細胞TYK-nu.CP-rを用いた。細胞増殖抑制活性：MTT法により評価した。DNAの断片化：アガロース電気泳動法により検出した。細胞周期：各化合物を暴露した細胞にヨウ化プロピジウムを作用させフローサイトメトリーにより解析した。細胞の形態学的変化：位相差顕微鏡による観察及びフローサイトメトリーによる解析を行った。＜結果・考察＞TYK-nu細胞では1,2-?H-Ampz、1,2-?H-Am-4mpzのいずれを暴露した場合でも、48時間まではアポトーシスに特徴的なDNAの断片化は認められず、72時間後にはじめて断片化が認められた。一方、TYK-nu.CP-r細胞では72時間目でもDNA の断片化は認められなかった。また、化合物を作用させたTYK-nuでアポトーシス誘導に特徴的な細胞の縮小が認められた。さらに、TYK-nu.CP-r細胞においては細胞の縮小だけでなく、アポトーシスに特徴的な細胞内小器官の凝集も確認された。これらの変化はどちらの細胞においても化合物の暴露時間に応じて経時的に増大することも明らかになった。これらのことから、TYK-nu.CP-r細胞ではDNAの断片化は認められなかったものの、1,2-?H-Ampzや1,2-?H-Am-4mpzはアポトーシスを誘導を介して細胞の増殖を抑制している可能性が示唆された。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P1】II-141 亜鉛のフリーラジカル性腎障害におけるPKC活性化とcAMP-PKA経路の関与 ○松永佳子1, 幸田祐佳1, 河合悦子1, 玄番宗一1（1大阪薬大・薬理）【目的】亜鉛は生体内微量元素の一つであり、サプリメントとして使用されている。亜鉛が脳神経細胞障害を引き起こすことが報告されているが、我々は腎細胞においてフリーラジカル性の細胞障害を引き起こすことを報告した。今回、亜鉛によるフリーラジカル性腎細胞障害へのPKCの関与とcAMP-PKA経路の役割について検討した。【方法】コンフルエンスに達した培養腎上皮細胞株LLC-PK1を無血清の培地に交換し、その2時間後に塩化亜鉛を添加した。一定時間後に、細胞障害の指標として、細胞から培地へのLDH遊離率を測定した。サイトゾル画分、ミクロソーム画分におけるPKC??の発現をウエスタンブロット法により測定した。【結果】 LLC-PK1において、亜鉛は濃度依存的、時間依存的に細胞障害を引き起こした。亜鉛による細胞障害は、抗酸化剤DPPDやスーパーオキシドアニオン消去薬SODにより抑制された。亜鉛によりPKC??はサイトゾル画分において減少し、ミクロソーム画分で増大した。このような増減は、細胞障害に先立って起こった。 PKC阻害薬であるGF109203XおよびGo6976は、このようなPKC??の各画分における増減および細胞障害を抑制した。cAMPは亜鉛によるPKC??の変動および細胞障害を抑制し、この効果はPKA阻害薬H-89によって消失した。【考察】亜鉛によるフリーラジカル性腎上皮細胞障害において、PKC??の早期のトランスロケーションが関与することが考えられる。また、cAMP-PKA経路が、亜鉛によるPKC??活性化の抑制を介して、フリーラジカル性腎細胞障害に保護的に働く可能性が示唆される。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P1】II-165 シスプラチンおよびネダプラチンによる腎細胞への取り込み量と腎障害発現との関係について ○谷内三郎1, 河合悦子1, 岡原茂喜1, 藤井彩1, 中村益久1, 玄番宗一1（1 大阪薬大）【目的】抗悪性腫瘍薬シスプラチンは、強力な抗腫瘍作用を示す。しかし一方で副作用である急性腎不全によりその使用が制限される。シスプラチンとほぼ同程度の抗腫瘍作用を示し腎毒性が低い白金錯体ネダプラチンが使用されている。しかし、なぜネダプラチンがシスプラチンに比べて腎毒性が低いのかは明確ではない。そこで、シスプラチンは腎に蓄積しその毒性を発現すると考えられていることから、シスプラチンとネダプラチンによる腎障害の程度と腎への蓄積量とを比較検討した。【方法】 6週齢SD系雄性ラットにネダプラチン(CDGP,7.5mg/kg、15mg/kg)およびシスプラチン(CDDP,7.5mg/kg、3.75mg/kg)をそれぞれ尾静脈内投与した。投与後 72時間後に腎機能の指標として、血中尿素窒素(BUN)、血漿クレアチニン(Pcr)および尿中へのN-acetyl-?-D-glucosaminidase(NAG)の排泄量を調べた。CDDPおよび CDGPの腎への蓄積量は、白金含量として原子吸光分光光度計測定をした。【結果】 CDDP、CDGPそれぞれ7.5mg/kgにおいて、CDGPのBUN、Pcrの上昇はCDDPに比べて1/3、NAGの尿中排泄量は1/4であり、白金の蓄積量は1/4であった。腎への白金の蓄積量は、CDDP3.75mg/kgとCDGP15mg/kgの条件でほぼ同程度であった。この蓄積量が同程度であった時において、BUNの上昇およびNAGの尿中への排泄量ともに同程度の障害を示した。【考察】今回の結果から、ネダプラチンはシスプラチンに比べて腎への蓄積性が低く、そのために腎障害の程度も低いことが示唆される。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P1】II-166 培養腎上皮細胞の低酸素後再酸素化によるフリーラジカル性障害への細胞内ATP含量の関与 ○中川麗子1, 河合悦子1, 玉井佐知子1, 玄番宗一1（1大阪薬大） [目的] 腎臓での虚血再灌流によって急性腎不全を発症する。その発症時に、ATP 含量の減少や活性酸素生成増大が引き起こされることが知られている。しかしATP 含量の低下と活性酸素産生増大との関係については明らかではない。そこで虚血性腎不全で障害を受けやすい近位尿細管様の性質をもつ培養腎上皮細胞株LLC-PK1 を用いて、虚血再灌流のインビトロモデルを作成し検討を行った。 [方法] コンフルエンスに達したLLC-PK1を1%O2/5%CO2(低酸素)のインキュベーター内で培養後、グルコースを添加し通常の酸素濃度下のCO2インキュベーターに移し培養することで再酸素化とした。SOD,Carboxy-PTIO,DPPDおよびアデノシンは低酸素開始前に添加した。細胞内ATP含量はルシフェリン/ルシフェラーゼ発光試薬を用いて測定し、細胞障害の指標として細胞から培地へのLDH遊離率を測定した。 [結果] 低酸素後、細胞内ATP含量はコントロールの約25%に低下し、再酸素化により約60％まで回復した。低酸素-再酸素化後、LDH遊離率は上昇した。再酸素化開始時にグルコースを添加しないと、低酸素-再酸素化後のATP含量の回復は小さく、細胞障害も増強された。アデノシンは低酸素-再酸素化後のATP含量をコントロールレベルまで回復させ、LDH遊離率の増大をほぼ完全に抑制した。 SOD,Carboxy-PTIOおよびDPPDは、低酸素再酸素化後のLDH遊離率の増大を抑制したが、ATP含量の回復には影響を及ぼさなかった。 [考察] LLC-PK1細胞において、低酸素による細胞内ATP含量の低下とその後の再酸素化における活性酸素やNOの生成に影響し、その結果細胞障害を引き起こすことが示唆される。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P1】III-148 ラット小腸CYP3Aによるカルバマゼピンの代謝とその阻害効果の評価 ○川口敏弘1, 岩永一範1, 宮崎誠1, 掛見正郎1（1大阪薬大）【目的】カルバマゼピン(CBZ)は，ヒト肝臓においてCYP3A4により活性代謝物であるカルバマゼピン10,11-エポキシ体(CBZ-E)へと代謝されることが知られているが，小腸での代謝に関する情報はほとんど得られていない．本薬物のように代謝物が活性を有する場合，小腸代謝の有無は経口投与後のbioavailability(BA)への影響のみならず，薬効に影響をおよぼす可能性があり，この点について明らかにしておくことは重要である．そこで本研究では，CBZ経口投与後の小腸CYP3Aによる代謝およびケトコナゾール(KTZ)によるその阻害効果についてラットを用いて検討した．【方法】in situ loop実験：ウレタン麻酔下Wistar系雄性ラットの小腸上部に10cm のループを作成した．ループ内にCBZ溶液(4mM)を1mL投与後，経時的に門脈血を採取しCBZ濃度を測定した．また別にKTZ溶液(500?M)により30分間前処理を行った小腸ループを用いて同様の実験を行った．incubation実験：常法に従い，ラット小腸上部の粘膜を用いて調製したミクロソームにKTZ(0.01-10?M)の存在,非存在下， CBZを添加してincubationを行い，CBZ-Eの生成速度を算出した．【結果・考察】in situ loop実験の結果，門脈血中にCBZ-Eが検出されたことから，肝のみならず小腸においてもCBZは代謝を受けることが明らかとなった．KTZ 前処理により，非処理群と比較して門脈血中CBZ濃度は有意に増大し，小腸におけるCBZの代謝がKTZにより阻害される可能性が示された．さらに，小腸ミクロソームを用いた代謝阻害実験によっても，CBZの代謝はKTZにより阻害されることが確認された．以上のことから，CBZをヒトに経口投与した際にも，小腸CYP3A4により代謝される可能性があると考えられる． - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P2】III-256 糖尿病治療に対するグリセミッククリアランスの有用性 ○佐藤眞治1, 峰尾茂2, 前島大輔2, 竹石欣司2, 宮崎誠3, 掛見正郎3（1新潟薬大,2ブルボン,3大阪薬大）【目的】糖尿病に対する治療は薬物単独で行われることは少なく、通常食事療法あるいは運動療法を併用して行われる。食物摂取に伴う血糖値の上昇は、食品に含まれる糖質量に正比例するものでなく、糖質の質ならびに加工法と調理法によって異なることが判明している。グリセミックインデックス（ＧＩ）とは食品の血糖上昇能を示す指標であり、糖尿病の食事療法の設定に用いられる値である。しかし、このＧＩ値は血糖値の時間的推移だけから得られる値であり、インスリン動態や作用強度を忠実に反映している値ではない。最終的に得られたＧＩ値がインスリン動態を正しく反映していない場合、得られたＧＩ値を利用した食事療法は、糖尿病の治療に対して無効あるいは病態の増悪にも関与すると考えられる。そこで、各種糖質投与後の血糖値及び血漿中インスリン濃度の変動を経時的に測定し、両者の変動を定量的に説明できるグリセミッククリアランスモデルを構築することを目的として本研究を行った。【方法】実験日前日に静脈にカニューレを施したWistar系雄性ラットを用いた。グルコースを静脈内に定速注入し、注入中注入停止後の血糖値及び血漿中インスリン濃度の変動を経時的に測定した。更に、ショ糖、トレーランＧ、小麦粉及び難消化性デキストリン含有食品を経口投与し、同様の検討を行った。血糖値及びインスリン濃度の測定は、グルコースオキシダーゼ法及びEIA法を用いた。【結果及び考察】グルコース注入中注入停止後の血糖値の変動及びインスリン動態を構築したモデルを用いて解析を行った結果、両者の変動を定量的に説明できることが明らかとなった。また、各種糖類経口投与後の変動についても構築したモデルを用いて定量的に説明可能であった。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P2】III-257 サケカルシトニンの薬理効果からの体内動態およびBAの予測 ○星野尚也1, 宮崎誠1, 岩永一範1, 掛見正郎1（1大阪薬大）【目的】サケカルシトニン(sCT)をはじめとするペプチド性医薬品は微量でも生理活性が極めて高いため、通常の投与量では定量限界の問題から体内動態を測定できないことも少なくない。一方、薬物のPKとPDを関連づけることにより、薬理効果のみから体内動態やBAを予測することも試みられている。先の日本医療薬学会において私たちはsCTの投与速度を変化させることで薬効強度が有意に影響されることを報告した。今回、経皮吸収製剤を用いて、その薬効強度からBAや体内動態の予測が可能であるか検討を行った。【方法】〈薬物投与〉実験にはWistar系雄性ラットを用いた。sCTを様々な投与量、投与速度でラットにinfusion投与した。〈製剤の調製法〉リン脂質とコール酸をEtOHに溶解したものにsCTを含有したPBS溶液を一定の比率で混合することで調製した。〈経皮投与〉剃毛したラットの腹部に薬物ドナーセルとしてプラスチック製カップを接着することで有効面積を一定とし、製剤を投与した。〈分析方法〉大腿静脈より血液を経時的に採取し、血漿中Ca濃度をOCPC法で測定した。〈AUE算出法〉血漿中Ca濃度の基底値と血漿中Ca濃度時間曲線で囲まれた面積をsCTの薬効強度指標AUEとした。【結果・考察】infusion投与時と経皮吸収製剤を用いた時のAUEを用いてsCTのPA を算出したところ、投与速度により有意に変化することが明らかとなった。したがって薬理効果のみからBAや体内動態の予測を行う際には、薬物の投与速度を充分に考慮した上で評価する必要性が示唆された。また、吸収速度が遅い経皮吸収製剤のBAや体内動態は、その製剤の吸収速度に応じた適切な投与速度を選択することで予測が可能であると考えられる。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P2】III-258 SU剤のMechanism based PK/PD に及ぼす日内リズムの影響 ○孫谷弘明1, 宮崎誠1, 岩永一範1, 掛見正郎1（1大阪薬大） [目的]生物における生体恒常系やホルモンの多くには日内リズムの存在が知られており、当研究室でもこれまでにラットにおいて血糖値や血漿中インスリンに日内リズムがあることを報告している。またSU剤のTolbutamide(Tb)および Glibenclamide(Gb)をインスリン日内リズムの極小値、極大値である6時および18 時にそれぞれi.v. bolus投与した場合、投与時刻間で血糖低下効果に顕著な差が見られることがわかった。今回は、各SU剤の受容体占有率と各SU剤投与後のインスリン分泌挙動の点から、投与時刻による血糖低下作用の差を検討した。 [方法] Wistar系雄性ラットを明暗12時間(6:00点灯、18:00消灯)サイクル下で一週間以上飼育し順応させた。実験18時間前までに大腿静脈、および頸静脈にカニュレーションを施し、実験開始まで絶食させたが飲料水は自由に与えた。実験当日は、大腿静脈から単回i.v. bolus投与し、頸静脈から経時的に採血した。血液は直ちに遠心分離して血漿を分取し、薬物濃度、血糖値、インスリン濃度をそれぞれ測定した。SU剤の受容体占有率φは、各薬物の血漿中遊離型薬物濃度Cfおよび平衡解離定数Kdを用いてφ=[Cf]/([Kd]+[Cf])から算出した。 [結果・考察]各SU剤投与後の血漿中インスリン分泌挙動は、ともに一過性の上昇を示したのち速やかに基底値まで消失し、投与時刻による分泌量の差はほとんど見られなかった。一方、Tbの受容体占有率時間推移に時刻差はほとんど見られなかった。これらのことからSU剤投与後の血糖低下作用の時刻差は、主にインスリンの作用である脂肪細胞や筋組織での糖取り込み機構が持つ日内リズムによるものであることが示唆された。したがってSU剤の血糖低下効果を表すには末梢における糖取り込みの日内リズムを考慮する必要があると考えられる。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P2】III-259 高血圧治療薬セリプロロールの糖尿病改善効果に関する Pharmacokinetics-Pharmacodynamics ○宮崎誠1, 臼井麻美子1, 佐藤美希1, 岩永一範1, 掛見正郎1（1大阪薬大）【目的】2型糖尿病患者の30％以上は高血圧であると報告されており，これら病態の共通の基盤としてインスリン抵抗性が挙げられている．現在，これら患者に対する治療では血糖管理とともに降圧剤による高血圧治療が行われている．近年，血管拡張性を有するβ遮断薬が降圧作用以外にも糖尿病の病態を改善することが報告されているが，薬物の体内動態と降圧作用および糖尿病改善効果との関係については明らかでない．そこで，本研究ではセリプロロールをモデル薬物としラットにおける体内動態と血圧および血糖などに対する影響について検討を行った．【方法】塩酸セリプロロールは生理食塩液に溶解した．動物にはWistar系雄性ラット（8週齢）を用い，無麻酔下，頚静脈より薬物を1または4時間infusion投与した．また，薬物をALZET(r)ミニ浸透圧ポンプに充填後，動物の皮下に埋め込み無麻酔・非拘束下2週間連続投与した．対照群には生理食塩液をポンプに充填し，同様の実験を行った．投与開始後，経時的に血圧測定または採血した．血漿中薬物濃度はLC-MS法で，絶食時血糖値（FBS）および血漿中トリグリセライド（TG）を吸光光度法で定量した．【結果・考察】1時間infusion投与後の血漿中薬物濃度は2-コンパートメントモデルで表すことができた．infusion開始後3時間までに血圧は次第に低下し，この降圧効果は血中薬物濃度よりも遅れて発現していることが明らかとなった．投与開始前と比較し4時間infusion期間中のFBSおよびTGに有意な変化は見られなかった．一方，皮下投与開始30時間以降の血中薬物濃度は実験終了時まで一定であった．対照群に比べて血中TG濃度は皮下投与実験期間中変化しなかったが，投与開始2日目以降に血圧が低下するとともに，4日目以降にFBSが低下傾向を示した．以上より，降圧を示す投与量でセリプロロールを24時間連続投与することで，FBSが低下することが明らかとなった． - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P2】III-263 血中digoxin動態に及ぼすlipopolysaccharideの影響 ○藤原あずさ1, 天野富美夫1, 川上有香1, 政田沙世子1, 山下哲史1, 西堀崇子1, 廣谷芳彦1, 田中一彦1（1大阪薬大）【目的】P-glycoprotein（P-gp）は脳、腸管、肝臓、腎臓などに発現し、多くの薬物の排出に関与しているトランスポーターであり、その基質となる薬物の体内動態に深く影響していることが報告されている。しかし、病態時のP-gp発現、機能変化に関しては十分な情報が得られていない。そこで、病態時におけるP-gpの発現変化、特に肝臓に及ぼす影響をendotoxinのlipopolysaccharide（LPS）を投与した感染症モデルにおいてP-gpの基質薬物であるdigoxin（Dx）を用いて検討した。【方法】Wistar雄性ラットにLPS 5mg/kg腹腔内投与24,48,72hr後にDxを0.1mg/kg 経口投与、その後経時的に採血を行った。血中Dx濃度はFPIA法（TDx(r)）により測定した。また、肝臓におけるP-gpのタンパク発現はLPS腹腔内投与後肝臓を摘出し、Western blottingにより評価した。【結果】LPS投与により血中Dx濃度が上昇し、Dx単独投与群に比し最高血中濃度（Cmax）、薬物血中濃度-時間曲線下面積（AUC）について有意な差が認められた。 P-gp発現はLPS投与前と比較し、12,24,48hr後で減少傾向が見られた。【考察】LPSを投与したラットの肝臓でのP-gp発現の減少が認められたことから、肝臓におけるP-gp減少が血中Dx濃度の上昇の一因と推測された。LPSが生体内での他の臓器のP-gpの発現に影響を与えた可能性も考えられ、現在、薬物の吸収に大きく関与する小腸のP-gp発現におけるLPSの影響についても関する検討を行っている。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P2】III-302 エトポシドとモルヒネの消化管吸収における相互作用の解析 ○南田望至1, 宮崎誠1, 岩永一範1, 掛見正郎1（1大阪薬大） [目的]Ｐ糖タンパク質（Pgp）は多剤耐性を獲得した癌細胞に過剰発現しているATP 駆動型トランスポーターである．しかし，Pgpは腫瘍細胞のみでなく正常組織にも広く存在し，薬物の排泄に関わっている．近年，小腸上皮細胞の刷子縁膜に存在するPgpが基質である薬物の消化管からの吸収を制限することが明らかとなってきた．Pgpは抗腫瘍薬のみならず，極めて幅広い基質認識性を有し，癌疼痛緩和薬として抗腫瘍薬との併用が考えられるモルヒネもPgpの基質であることが知られている．そこで抗腫瘍薬であるエトポシド(ETP)とモルヒネおよびキニジンとの経口併用時の相互作用について検討した． [方法]実験前日にエーテル麻酔下，Wistar系雄性ラット（体重 280-320g）の右頸静脈にカニューレーションを施した．ETPは臨床製剤ラステット(r)と等しい比率（54％）のポリエチレングリコール400に溶解し，硫酸モルヒネ，硫酸キニジンは精製水に溶解した．動物を一夜絶食後，ETP（30mg/kg）とモルヒネ(30mg/kg)もしくはキニジン(4mg/kg)を同時に経口投与した．薬物投与後，経時的に頸静脈から血液を採取し，血漿を前処理した後ETPをHPLC-UV法にて定量した． [結果・考察] ETPとPgpの基質であるキニジンとの併用時，またモルヒネとの併用時，いずれにおいてもETPの血中濃度は単独投与時と比べて上昇し， Bioavailabilityが増大した．このことから，吸収におけるPgp阻害の影響が示唆された．しかしモルヒネとの併用時にはキニジン併用の場合とは異なり，ETPの Cmaxの上昇とともにTmaxの遅延もみられた．このモルヒネによるETPの Bioavailabilityの増大にはPgp阻害以外の原因もあると考えられ，さらなる検討を要することがわかった． - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 30【P2】II-242 Aminoglycosideの透析膜への吸着性に関する基礎的研究 ○浦田元樹1,2, 西原舞1,2, 平田純生2, 和泉智2, 古久保拓2, 太田美由希 2, 藤田みのり2, 山川智之3, 田中一彦1（1大阪薬大,2白鷺病院薬,3白鷺病院診療部）【目的】透析患者にaminoglycoside（AGs）を投与する場合、透析による除去を考慮する必要がある。一般的に透析による薬物除去は拡散や限外濾過の原理によると考えられているが、透析膜への吸着も報告されている。そこで今回、AGsの透析膜への吸着性についての基礎的検討を行った。【方法】AGsとしてarbekacin（ABK）、gentamicin（GM）、tobramycin（TOB）、 amikacin（AMK）を、透析膜としてpolysulfone（PS）、sulfonated polyacrylonitrile（AN69）を用いた。AGsをpH 7.4のリン酸緩衝液加生理食塩液にて10、20 μg/mLにした。AGs溶液10 mLと5 mm幅に裁断した膜面積1.5 cm2相当の透析膜を30分間温浴中で攪拌させ、実験前後の濃度を測定した。統計解析には Student's unpaired t-testを用い、危険率5％未満を有意とした。【結果】10、20 μg/mLにおいて全てのAGsともPSに対しては吸着せず、AN69に対して高い吸着率を示した。しかし、AMKのAN69への吸着率はABK、GM、TOBと比較すると有意に低かった。【考察】PSは荷電を持たず、AN69は強い陰性荷電を有する透析膜である。今回、 AN69に対して高い吸着率を示したのは、陽性荷電薬物であるAGsとAN69がイオン結合したためと考えられた。AMKのAN69への吸着率が他のAGsに比べて低かったのは、 AGsの持つ陽性荷電の強さが関係していると考えられたが、詳細は更に検討する必要がある。しかしながら、AN69に対して全てのAGsが強い吸着性を示したので、 AN69使用時には吸着による除去を考慮する必要があると考えられた。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 29【P2】I-482 チャンネル形成ペプチドを用いたオリゴヌクレオチドの細胞内導入 ○和田俊一1, 田中麗子1（1大阪薬大）【目的】真菌由来ペプチド，TV-XIIaは膜中で自己凝集し，チャンネルを形成することが報告されている.1) TV-XIIaをベースにした合成ペプチドを用いて，アンチセンス療法に用いられるオリゴヌクレオチド (ODN) の細胞内導入を検討する．【方法】ペプチドのN-末端側にチャンネル形成を誘発するアミノ酸配列，C-末端側に静電的にODNと結合するアミノ酸配列をデザインし，本ペプチド (Ac-U-N-I-I-U-P-L-L-U-P-I-K-K-K-K-K-K-K-K-K-K, U: ?-aminoisobutyric acid) を Fmoc-固層合成法で合成した．ODN は，5'-末端側を fluorescein で蛍光標識したホスホロチオエート型 20 mer ODN を用いた．ODN/ペプチドを種々のモル比でプレインキュベーションし複合体を形成させ，ODN/ペプチド複合体をNIH/3T3, A549細胞に投与した．37度，2時間インキュベーション後，共焦点レーザー顕微鏡で蛍光観察し，ODNの細胞内への移行性を検討した．また，ODN/ペプチド複合体の細胞毒性を乳酸脱水素酵素 (LDH) の漏出を測定することにより行なった．【結果】共焦点レーザー顕微鏡で細胞を蛍光観察したところ，NIH/3T3細胞では， ODN/ペプチドのモル比1/10~1/20の間でLDHの漏出なしにODNの膜透過性が観察された．一方，A549細胞においては，同モル比の範囲内では，ODNの膜への集積が認められ，細胞内への移行が観察されなかった．また，NIH/3T3細胞では，エンドサイトーシスが抑制される低温条件下でもODNの細胞内への移行が観察された．【文献】S. Wada, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 6 (19), 2275 (1996). - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 以上